利(li)用(yong)布魯(lu)克(ke)的定(ding)量軟(ruan)件(jian)包， 進行自由基和(he)過渡(du)金屬的(de)鑒(jian)定和(he)定量

EPR

利(li)用(yong)布(bu)魯(lu)克(ke)的定(ding)量軟(ruan)件(jian)包，

進行自由基和(he)過渡(du)金屬的(de)鑒(jian)定和(he)定量

秉(bing)持(chi)誠信(xin) 不(bu)斷(duan)創(chuang)新

摘要

在科(ke)學(xue)研究(jiu)和(he)過程(cheng)/質量控(kong)制(zhi)中利(li)用(yong)分析(xi)技術鑒(jian)定和(he)定量特定(ding)物種(zhong)，是(shi)壹(yi)項挑戰(zhan)。電子(zi)順磁共振(zhen)（EPR）波譜就(jiu)是這(zhe)樣壹(yi)項 技術，它(ta)適(shi)用(yong)於鑒(jian)定和(he)定量液(ye)體(ti)或(huo)固體(ti)樣品中的(de)自(zi)由基和(he)過渡(du)金屬離子(zi)。憑(ping)借獲(huo)由SpinCount和(he)SpinFit模塊(kuai)組(zu)成 的(de)定(ding)量軟(ruan)件(jian)包，布(bu)魯(lu)克(ke)讓EPR技術變得更(geng)易用、更(geng)便(bian)捷。該定(ding)量軟(ruan)件(jian)包對(dui)於所(suo)有采(cai)用Xenon和(he)Xepr軟(ruan)件(jian)的布(bu)魯(lu)克(ke)EPR波譜儀 是標配(pei)，對(dui)於采(cai)用ESRStudio軟(ruan)件(jian)的Magnettech ESR5000波(bo)譜儀是可選項。該定(ding)量軟(ruan)件(jian)包可直(zhi)接實現樣品的(de)精準(zhun)定量，而(er) 無(wu)需與標準(zhun)樣品或(huo)單獨測(ce)得的(de)校(xiao)準(zhun)曲(qu)線進行比較(jiao)。由此(ci)布(bu)魯(lu)克(ke)可為眾(zhong)多(duo)不(bu)同的(de)科學(xue)研究(jiu)或(huo)過程(cheng)/質量控(kong)制(zhi)提供(gong)壹(yi)種(zhong)可靠易 用的(de)解(jie)決方案(an)。

引言

利用波譜技術對(dui)樣品中的(de)特定(ding)物種(zhong)進行定性(xing)或(huo)定量，是(shi)進行科學(xue)研究(jiu)和(he)過程(cheng)/質量控(kong)制(zhi)的基礎。電子(zi)順磁共振(zhen)（EPR）波譜 讓研究(jiu)人(ren)員能(neng)夠鑒(jian)定和(he)定量樣品中的(de)自(zi)由基和(he)過渡(du)金屬離子(zi)。和(he)大(da)多(duo)數(shu)光(guang)譜技術不同的(de)是，EPR對(dui)樣品不(bu)透明(ming)度或濁(zhuo)度沒(mei) 有(you)限制(zhi)，且定量信(xin)息不依(yi)賴(lai)於消(xiao)光(guang)系(xi)數(shu)的(de)精度。通過EPR鑒(jian)定順磁性物(wu)質只取決於物(wu)種(zhong)本(ben)身(shen)的(de)性質(zhi)。與核磁共振(zhen)（NMR）波 譜等其(qi)他(ta)磁共振(zhen)技術不同的(de)是，EPR不受(shou)分子量的(de)限制(zhi)。只需對(dui)來自目(mu)標(biao)自由基或過渡(du)金屬離子(zi)的EPR信(xin)號(hao)進行二重(zhong)積(ji)分，  即可獲(huo)得定(ding)量信(xin)息，可以(yi)免(mian)於來自非順磁性物(wu)質的幹擾(rao)。然而(er)，即(ji)使(shi)是(shi)用EPR來鑒(jian)定物(wu)種(zhong)也(ye)依(yi)賴(lai)於知(zhi)識儲(chu)備，且定量時(shi)通(tong)常(chang) 需要花費(fei)大(da)量時(shi)間(jian)去構建(jian)標準(zhun)曲(qu)線。

為了解(jie)決(jue)所有光(guang)譜技術存在的(de)共(gong)同局(ju)限及(ji)EPR存在的(de)挑(tiao)戰，布魯(lu)克(ke)打(da)造出了榮獲(huo)SpinFit和(he)SpinCount軟(ruan)件(jian)包。該軟(ruan) 件(jian)包能(neng)夠無需參比(bi)物直(zhi)接定量和(he)明(ming)確(que)鑒(jian)定不(bu)同樣品中的(de)順磁性物(wu)質。SpinCount讓研究(jiu)人(ren)員能(neng)夠從(cong)原(yuan)始數(shu)據(ju)中獲(huo)取定(ding)量信(xin) 息，而無(wu)需與標準(zhun)樣品進行比較(jiao)，亦(yi)無(wu)需用到校(xiao)準(zhun)曲(qu)線。SpinFit模塊及其(qi)中所(suo)含(han)的常(chang)見自由基和(he)過渡(du)金屬離子(zi)的譜圖庫， 讓研究(jiu)人(ren)員即(ji)使只具(ju)備很少的(de)知識儲(chu)備也能(neng)鑒(jian)定出物種(zhong)。取(qu)決於所(suo)用軟(ruan)件(jian)，EPR波譜儀最多(duo)可配置(zhi)來自SpinFit家族的(de)三(san)個(ge) 成員(yuan)： Isotropic SpinFit、SpinFit Liquids和(he)Aniso SpinFit。SpinFit通過將(jiang)原(yuan)始數(shu)據(ju)與壹(yi)個(ge)小(xiao)參數(shu)集(ji)進行擬合來輕松實現物(wu) 種(zhong)鑒(jian)定，而(er)用(yong)戶(hu)只需輸(shu)入很(hen)少的(de)信(xin)息。Isotropic SpinFit和(he)SpinFit Liquids是用(yong)於模(mo)擬和(he)擬合溶(rong)液(ye)中的(de)自(zi)由基和(he)過渡(du)金屬的(de) CW-EPR譜圖的程序。Isotropic SpinFit用(yong)於模(mo)擬和(he)擬合非粘性(xing)溶(rong)液(ye)的(de)各(ge)向(xiang)同性(xing)譜圖。SpinFit Liquids對(dui)這壹(yi)功能(neng)進行了擴 展(zhan)，增加(jia)了測(ce)定溶(rong)液(ye)中自(zi)由基翻(fan)滾(gun)速度（旋(xuan)轉(zhuan)相關(guan)時間(jian)）的功能(neng)。模(mo)擬不同運(yun)動(dong)狀(zhuang)態(tai)下的(de)譜圖，需要在能(neng)自(zi)動(dong)確定運(yun)動(dong)狀(zhuang)態(tai) 的SpinFit Liquids中實現的(de)不同理論描(miao)述(shu)。Anisotropic SpinFit用於模(mo)擬冷凍溶(rong)液(ye)和(he)粉末(mo)的譜圖。

SpinCount無需參比(bi)物即(ji)可實現定(ding)量

. 高(gao)精度，無需參比(bi)物，通(tong)過二重(zhong)積(ji)分直(zhi)接利用原(yuan)始數(shu)據(ju)計(ji)算出濃(nong)度

. 在SpinCount的(de)計(ji)算中涵(han)蓋了(le)儀器參數(shu)的(de)影響

. 集(ji)成(cheng)於波(bo)譜儀的控制(zhi)軟(ruan)件(jian)，使得研究(jiu)人(ren)員可在完(wan)成(cheng)數(shu)據(ju)采集(ji)後立(li)即(ji)輕(qing)松快速地(di)實現自(zi)由基定量

圖(tu)1所(suo)示為，利用(yong)SpinCount進行290 K溫度下的(de)硫(liu)酸(suan)氧釩(fan)（VOSO4）水溶(rong)液(ye)的(de)定(ding)量。用(yong)戶(hu)只需在SpinCount中利(li)用(yong)區(qu)域(yu)限定(ding)工(gong)具(ju) 選擇二重(zhong)積(ji)分區域(yu)，該區(qu)域(yu)的二重(zhong)積(ji)分然後(hou)被(bei)換算成樣品中的(de)總(zong)自(zi)旋(xuan)數(shu)、自(zi)旋(xuan)摩爾濃(nong)度及單位體(ti)積自(zi)旋(xuan)數(shu)(spins/mm3)。

圖(tu)1：實驗譜圖顯示為紅(hong)色。 通過對(dui)實驗譜圖進行二重(zhong)積(ji) 分（藍色），SpinCount確定    出自旋(xuan)數(shu)、摩爾濃(nong)度和(he)自旋(xuan)   數(shu)/mm3，如(ru)絕(jue)對(dui)自旋(xuan)數(shu)報告(gao) 中所(suo)示。

壹(yi)個(ge)重(zhong)要的註(zhu)意(yi)事(shi)項是不(bu)同的(de)樣品條(tiao)件。例如，觀(guan)測(ce)到的(de)EPR譜圖會(hui)隨溫度的變(bian)化而變化，這(zhe)會(hui)導(dao)致(zhi)在不(bu)同溫(wen)度下研究(jiu)的(de)相同 樣品所(suo)獲(huo)得的(de)二重(zhong)積(ji)分不同。正如圖(tu)2所示，其(qi)中顯(xian)示了來自圖(tu)1的(de)VOSO4樣品在150 K溫(wen)度下處(chu)於冷(leng)凍狀(zhuang)態(tai)時所(suo)觀測(ce)到的(de)譜 圖。SpinCount在計(ji)算中考(kao)慮到了(le)樣品溫(wen)度，因此(ci)可以(yi)提供(gong)壹(yi)致(zhi)的(de)定量信(xin)息，而不(bu)受(shou)二重(zhong)積(ji)分的變(bian)化(hua)影響。這(zhe)也(ye)適(shi)用(yong)於未(wei)發(fa)生(sheng) 相應(ying)溫度變化(hua)時的物理狀(zhuang)態(tai)改變(bian)，因為從(cong)液(ye)態(tai)到固態(tai)的相變(bian)會(hui)以(yi)類(lei)似的(de)方(fang)式(shi)導(dao)致(zhi)譜圖改變。

圖(tu)2：在150 K溫(wen)度下研究(jiu)來 自圖(tu)1的(de)、處於冷(leng)凍狀(zhuang)態(tai)的相 同VOSO4樣品。SpinCount采(cai) 用相同的(de)二重(zhong)積(ji)分方法從(cong)實 驗譜圖中計(ji)算出自旋(xuan)數(shu)、摩 爾濃(nong)度及自(zi)旋(xuan)數(shu)/mm3。

利(li)用(yong)SpinFit模(mo)塊(kuai)輕松快速地(di)鑒(jian)定自(zi)由基

. 用於處(chu)理固態(tai)（Aniso SpinFit）和(he)液(ye)態(tai)（SpinFit Isotropic和(he)SpinFit Liquids）樣品中的(de)自(zi)由基和(he)過渡(du)金屬物(wu)種(zhong)

. 擁(yong)有(you)鑒(jian)定時(shi)常(chang)見物種(zhong)的(de)譜圖庫

. 能夠(gou)鑒(jian)定和(he)解析(xi)多(duo)個(ge)物種(zhong)

. 與SpinCount輕松對(dui)接

. 自動(dong)選擇動(dong)態(tai)機制(zhi)（SpinFit Liquids）

. 集成(cheng)於波(bo)譜儀的控制(zhi)軟(ruan)件(jian)，使得研究(jiu)人(ren)員可在完(wan)成(cheng)數(shu)據(ju)采集(ji)後立(li)即(ji)輕(qing)松快速地(di)完成(cheng)順磁性物(wu)質鑒(jian)定

順磁性物(wu)質的未(wei)成(cheng)對(dui)電子(zi)會(hui)與它(ta)們(men)的(de)局(ju)部(bu)環(huan)境(jing)相互(hu)作用(yong)，從(cong)而(er)產(chan)生(sheng)可用於鑒(jian)定該物(wu)質(zhi)的特征(zheng)EPR譜圖。SpinFit通過將(jiang)原(yuan)始數(shu) 據(ju)與壹(yi)個(ge)小(xiao)參數(shu)集(ji)進行擬合來輕松實現物(wu)種(zhong)鑒(jian)定，而(er)用(yong)戶(hu)只需輸(shu)入很(hen)少的(de)信(xin)息。當(dang)順磁性物(wu)種(zhong)未(wei)知時(shi)，SpinFit擁(yong)有(you)壹(yi)個(ge)全(quan)面 的(de)常(chang)見自由基和(he)過渡(du)金屬譜圖庫，並(bing)帶有相應(ying)的擬合參數(shu)，可幫(bang)助(zhu)實現輕(qing)松快速的物(wu)種(zhong)鑒(jian)定。由於處(chu)於液(ye)體(ti)和(he)固體(ti)狀(zhuang)態(tai)的樣品 都能(neng)進行研究(jiu)，SpinFit提供(gong)了(le)不同的(de)參數(shu)選擇來滿足(zu)每(mei)種(zhong)樣品狀(zhuang)態(tai)所需考慮的(de)不同參數(shu)。圖(tu)3所(suo)示為，利用(yong)SpinFit Isotropic來 擬合在290 K下(xia)研究(jiu)的(de)VOSO4樣品的(de)譜圖。用戶只需輸(shu)入或(huo)上(shang)傳壹(yi)組(zu)起始參數(shu)，SpinFit Isotropic即(ji)可自動(dong)找到精準(zhun)地(di)擬合該 譜圖所需的正確參數(shu)集(ji)。

圖(tu)3：處(chu)於液(ye)體(ti)狀(zhuang)態(tai)的VOSO4 樣品的(de)實驗譜圖（藍色），顯   示出由8條(tiao)譜線組(zu)成的(de)特征(zheng)   裂分譜線⃞源自未(wei)成(cheng)對(dui)電  子(zi)與MI  = 7/2釩核之間(jian)的超  精細耦合(he)。擬合譜圖所用的(de)   參數(shu)顯(xian)示在Spin Fitting窗(chuang)口中，獲(huo)得的(de)擬合譜圖顯示 為紅(hong)色。

與此同時(shi)，Aniso SpinFit能夠滿足(zu)擬合固態(tai)樣品的(de)譜圖所需的額(e)外(wai)參數(shu)。圖(tu)4所(suo)示為，利用(yong)Aniso SpinFit來鑒(jian)定來自圖(tu)2的(de)、處 於冷(leng)凍狀(zhuang)態(tai)的VOSO4樣品。和(he)液(ye)態(tai)樣品壹(yi)樣，用戶(hu)可以(yi)輸(shu)入或(huo)者(zhe)直(zhi)接從(cong)譜圖庫上(shang)傳所有參數(shu)。

圖(tu)4：在150 K溫(wen)度下研究(jiu)來自圖(tu)1和(he)圖3的(de)VOSO4樣  品時(shi)，獲(huo)得了(le)與固態(tai)樣品壹(yi)致(zhi)的(de)譜圖。進行擬合時，Aniso SpinFit考慮了(le)全(quan)   面描(miao)述(shu)固態(tai)樣品的(de)譜圖所需 的額(e)外(wai)參數(shu)。

SpinCount與SpinFit模塊聯(lian)用

. 即使信(xin)噪(zao)比低(di)，也(ye)能(neng)實現高(gao)精度定量

. 解(jie)析(xi)多(duo)個(ge)重(zhong)疊(die)譜圖，以(yi)測(ce)定它(ta)們(men)各(ge)自(zi)的濃(nong)度

. 借助(zhu)SpinFit模塊(kuai)也可獲(huo)得原(yuan)始數(shu)據(ju)中包含(han)的相同定(ding)量信(xin)息

前(qian)面的例子證(zheng)明(ming)，SpinCount能(neng)夠(gou)將EPR譜圖轉換成(cheng)樣品中的(de)自(zi)旋(xuan)數(shu)，SpinFit模(mo)塊(kuai)能(neng)夠(gou)擬合EPR譜圖。研究(jiu)人(ren)員面(mian)臨(lin)的(de)壹(yi)個(ge)常(chang) 見問(wen)題是，從(cong)含(han)有多(duo)種(zhong)順磁性物(wu)質的樣品中獲(huo)取定(ding)量信(xin)息時，會(hui)受(shou)到譜圖重(zhong)疊(die)的(de)幹擾(rao)。在這(zhe)種(zhong)情況(kuang)下(xia)，無(wu)法利用(yong)譜圖的二重(zhong)積(ji) 分來獲(huo)得單個(ge)物種(zhong)的(de)定量信(xin)息。通過將(jiang)SpinFit與SpinCount的功能(neng)相結(jie)合，即可獲(huo)得含(han)多(duo)種(zhong)物(wu)質的(de)樣品的(de)定量信(xin)息。SpinFit 將實驗譜圖與包含(han)多(duo)種(zhong)物(wu)質的(de)模型譜圖進行擬合，並(bing)分離出單個(ge)譜圖。然後，SpinCount通(tong)過計(ji)算而(er)非二重(zhong)積(ji)分來獲(huo)得定(ding)量 信(xin)息。例如，圖(tu)5中的(de)譜圖即源自於由三(san)張(zhang)譜圖組(zu)成的(de)重(zhong)疊(die)譜圖，每(mei)張(zhang)譜圖對(dui)應於聚(ju)山梨(li)酯的(de)三(san)種(zhong)不(bu)同氧(yang)化產物(wu)之壹(yi)。通(tong)過 SpinFit Isotropic鑒(jian)定出三(san)種(zhong)聚(ju)山梨(li)酯自(zi)由基後，再(zai)通過SpinCount分別(bie)進行每(mei)種(zhong)自(zi)由基的定(ding)量。如(ru)此(ci)，即使是含(han)有多(duo)種(zhong)物(wu)質的(de) 樣品，SpinFit Isotropic也(ye)能輕松實現樣品中單個(ge)物種(zhong)的(de)鑒(jian)定和(he)定量。

圖(tu)5：實驗譜圖（黑色）是從(cong)聚(ju)山梨(li)酯自(zi)由基混(hun)合物(wu)中收(shou) 集(ji)到的(de)原(yuan)始數(shu)據(ju)。模擬譜圖   （藍色虛(xu)線(xian)）是(shi)分別(bie)顯示為黃(huang)色（烷(wan)基）、綠(lv)色（烷(wan)氧(yang)

基）和(he)橙色（過氧(yang)基）的三(san)張(zhang)譜圖的總和(he)。模擬譜圖是根據(ju) 各(ge)自(zi)所顯示的濃(nong)度對(dui)三(san)份單張(zhang)譜圖進行加(jia)權求(qiu)和(he)所得。SpinFit Isotropic同時(shi)計(ji)   算出每(mei)張(zhang)譜圖及三(san)張(zhang)譜圖之  和(he)，使得每(mei)個(ge)物種(zhong)可被(bei)單獨   地(di)分離出並(bing)進行分析(xi)。因(yin)此， 盡管(guan)譜圖重(zhong)疊(die)，SpinCount也(ye) 可利用(yong)該信(xin)息給出每(mei)個(ge)物種(zhong)  的(de)濃(nong)度。

圖6和(he)圖7所(suo)示為，如何利(li)用Aniso SpinFit 進行混(hun)合物(wu)樣品的(de)鑒(jian)定和(he)定量。本(ben)例中的(de)譜圖源自於處(chu)於不(bu)同配(pei)位環境(jing)下(xia)的(de)過渡(du)金 屬配(pei)合物。通過對(dui)照Anisotropic SpinFit的譜圖庫，在譜圖中鑒(jian)定出低(di)自(zi)旋(xuan)和(he)高自(zi)旋(xuan)Fe(III)信(xin)號(hao)。Aniso SpinFit再(zai)自(zi)動(dong)找到精準(zhun) 地(di)擬合總譜圖所需的每(mei)個(ge)物種(zhong)的(de)正確參數(shu)。

圍(wei)6：實驗譜圖（藍色）源自於由處(chu)於不(bu)同配(pei)位環境(jing)下(xia)的(de) 三(san)種(zhong)血(xue)紅(hong)素(su)配合物組(zu)成的(de)混(hun)合物(wu)樣品。該數(shu)據(ju)改編(bian)自(zi)   （Ruetz, M.等(deng)人(ren)，遠(yuan)端(duan)配(pei)體(ti)   抑制(zhi)硫(liu)化(hua)氫(qing)與人(ren)神經(jing)球(qiu)蛋(dan)白 的相互(hu)作用(yong)，J. Biol. Chem., (2017) 292, 6512-6528）。通  過對(dui)照Aniso SpinFit的譜圖  庫，實驗譜圖被(bei)擬合（紅(hong)色） 成由三(san)張(zhang)不(bu)同Fe(III)譜圖疊(die)   加(jia)而成的總(zong)譜圖，這三(san)張(zhang)譜   圖分別(bie)對(dui)應於壹(yi)種(zhong)高(gao)自旋(xuan)配(pei) 合物和(he)兩種(zhong)低(di)自(zi)旋(xuan)配(pei)合物。 單張(zhang)譜圖顯示在圖(tu)7中。

圖(tu)7中的(de)譜圖是Aniso  SpinFit從(cong)圖(tu)6的(de)實驗譜圖中鑒(jian)定出的單張(zhang)譜圖。Aniso SpinFit根據(ju)每(mei)張(zhang)譜圖對(dui)總譜圖的相對(dui)貢獻計(ji)算出 每(mei)個(ge)物種(zhong)的(de)濃(nong)度。

圍(wei)7：Aniso SpinFit鑒(jian)定出三(san) 個(ge)Fe(III)物種(zhong)，SpinCount再(zai)  對(dui)每(mei)個(ge)物種(zhong)進行定量。從(cong)絕(jue)  對(dui)自旋(xuan)數(shu)報告(gao)中可以(yi)得出， 樣品中的(de)高(gao)自(zi)旋(xuan)Fe(III)物(wu)種(zhong)   （紅(hong)色譜圖）濃(nong)度為2.3 μM， 低(di)自(zi)旋(xuan)Fe(III)物(wu)種(zhong)（藍色譜圖）濃(nong)度為47 μM，另壹(yi)個(ge)低(di) 自(zi)旋(xuan)Fe(III)物(wu)種(zhong)（橙(cheng)色譜圖） 濃(nong)度為12 μM。

除(chu)了重(zhong)疊(die)譜圖，研究(jiu)人(ren)員還(hai)經(jing)常(chang)面(mian)臨(lin)自(zi)由基濃(nong)度低(di)導(dao)致(zhi)數(shu)據(ju)的信(xin)噪(zao)比低(di)的(de)挑(tiao)戰。濃(nong)度低(di)可能是(shi)由樣本量受(shou)限或(huo)所研究(jiu)反應(ying)的(de) 收(shou)率(lv)低(di)所(suo)造(zao)成的內在限制(zhi)。雖然(ran)可以(yi)使(shi)用(yong)信(xin)號(hao)平(ping)均法，但(dan)這會(hui)非常(chang)耗(hao)時(shi)，或者可能受(shou)到快速反應(ying)動(dong)力(li)學(xue)的(de)限制(zhi)。在這(zhe)種(zhong)情況(kuang) 下(xia)，SpinFit與SpinCount聯(lian)用同樣可以(yi)發(fa)揮良好(hao)的(de)作用(yong)。高噪(zao)聲(sheng)的實驗譜圖被(bei)擬合成無噪(zao)聲(sheng)的模(mo)擬譜圖，再通過模(mo)擬譜圖計(ji)算 出濃(nong)度。圖8中所(suo)示的條(tiao)形圖(tu)，對(dui)比了重(zhong)復(fu)測(ce)量自(zi)由基濃(nong)度為1 μM的樣品所(suo)得到的(de)結果。通過二重(zhong)積(ji)分確定(ding)濃(nong)度時，SpinCount 所(suo)得出的結(jie)果精度很低(di)。如(ru)果先(xian)用SpinFit擬合高噪(zao)聲(sheng)譜圖，再直(zhi)接計(ji)算出濃(nong)度，則(ze)精度可大(da)幅(fu)提高(gao)。

圖(tu)8：SpinCount通過對(dui)低(di)濃(nong)  度樣品的(de)EPR譜圖進行二重(zhong) 積(ji)分（橙色）來獲(huo)得定(ding)量結(jie)果 時，所(suo)得到的(de)RSD為21%。如果先(xian)擬合高噪(zao)聲(sheng)譜圖，再 直(zhi)接計(ji)算出濃(nong)度（藍色），則(ze) 精度可以(yi)提高(gao)，而(er)所得到的(de) RSD為3%。

SpinCount和(he)SpinFit讓二維數(shu)據(ju)分析(xi)變(bian)得更(geng)簡單

. 研究(jiu)外(wai)部刺(ci)激因(yin)素對(dui)EPR譜圖的影響，從(cong)而(er)構(gou)建(jian)二維數(shu)據(ju)集

. 考(kao)慮到外(wai)部刺(ci)激因(yin)素的物(wu)種(zhong)鑒(jian)定和(he)定量

布(bu)魯(lu)克(ke)EPR波譜儀擁(yong)有(you)豐(feng)富(fu)的附件，可用於進行眾(zhong)多(duo)不(bu)同類(lei)型的EPR研究(jiu)。通(tong)常(chang)需要監(jian)測(ce)樣品溫(wen)度或原(yuan)位紫(zi)外輻照(zhao)等(deng)常(chang)見外  部刺(ci)激因(yin)素對(dui)EPR譜圖的影響。獲(huo)得EPR譜圖在外(wai)部(bu)刺(ci)激因(yin)素的影響下(xia)隨時間(jian)的變(bian)化趨勢，可供深入了(le)解(jie)反應(ying)機制(zhi)和(he)動(dong)力(li)學(xue)。 為了能(neng)以(yi)這(zhe)樣的靈(ling)活性開(kai)展(zhan)實驗，布(bu)魯(lu)克(ke)EPR波譜儀提供(gong)了(le)壹(yi)些(xie)可選的壹(yi)維(wei)和(he)二維實驗類(lei)型。但(dan)對(dui)於多(duo)維(wei)EPR數(shu)據(ju)，分析(xi)過程(cheng)  可能非常(chang)耗(hao)時(shi)。為了解(jie)決(jue)這個(ge)問(wen)題，布魯(lu)克(ke)設計(ji)出了能(neng)夠(gou)逐層分析(xi)二維數(shu)據(ju)集的(de)SpinCount和(he)SpinFit軟(ruan)件(jian)包。

圖(tu)9所示為，如何通(tong)過Isotropic SpinFit與SpinCount聯(lian)用，來測(ce)定混(hun)合物(wu)樣品（如(ru)圖5中的(de)聚(ju)山梨(li)酯）中濃(nong)度隨時間(jian)發(fa)生(sheng)的(de)變化。 雖然(ran)圖(tu)5中的(de)單張(zhang)譜圖能夠反映(ying)聚(ju)山梨(li)酯發(fa)生(sheng)氧(yang)化反應(ying)的(de)過程(cheng)，但(dan)隨著時(shi)間(jian)的推(tui)移(yi)和(he)反應(ying)的(de)進行，每(mei)個(ge)物種(zhong)的(de)濃(nong)度也在上(shang)升(sheng)  或(huo)下降。演(yan)變(bian)譜圖能夠反映(ying)每(mei)個(ge)物種(zhong)的(de)濃(nong)度隨反應(ying)時(shi)間(jian)的推(tui)移(yi)而發(fa)生(sheng)的(de)變化。SpinCount的(de)結果顯示，可以(yi)同時(shi)計(ji)算每(mei)個(ge)物種(zhong)  的(de)濃(nong)度。即，通(tong)過SpinFit和(he)SpinCount的聯(lian)用，我們可以(yi)深入了(le)解(jie)每(mei)個(ge)物種(zhong)的(de)反應(ying)機制(zhi)或動(dong)力(li)學(xue)，即(ji)使(shi)樣品中含(han)有多(duo)種(zhong)物(wu)質。

圖(tu)9：通過采(cai)集隨反應(ying)時(shi)間(jian)  而變(bian)化的EPR譜圖，來觀測(ce)  EPR 譜圖在聚(ju)山梨(li)酯氧(yang)化(hua)  反應(ying)過程(cheng)中的(de)演(yan)變(bian)趨勢 。 濃(nong)度與時間(jian)的關(guan)系(xi)圖表(biao)明(ming)  了(le)，SpinCount如(ru)何在SpinFit  的(de)幫(bang)助(zhu)下，同時(shi)追蹤圖(tu)5中所(suo)  示的每(mei)個(ge)物種(zhong)濃(nong)度，即使(shi)它(ta)  們(men)的(de)譜圖重(zhong)疊(die)。

圖(tu)10給出了壹(yi)個(ge)利用(yong)SpinCount進行硝苯(ben)地(di)平(ping)自由基定量的(de)例子。在本(ben)例中，硝(xiao)苯(ben)地(di)平(ping)自由基是通(tong)過紫(zi)外光(guang)照射1.5小(xiao)時(shi)所(suo)產 生(sheng)。從(cong)譜圖中的(de)信(xin)號(hao)振(zhen)幅(fu)不斷變大(da)可以(yi)看(kan)出，自由基濃(nong)度隨照射時間(jian)的延長(chang)而(er)增加(jia)。SpinCount通過逐壹(yi)計(ji)算每(mei)個(ge)時間(jian)點的二 重(zhong)積(ji)分，來體現自(zi)由基濃(nong)度隨時間(jian)的變(bian)化。

圖10：硝苯地(di)平(ping)自由基是通(tong) 過紫(zi)外光(guang)照射所產生(sheng)。該圖(tu) 所(suo)示為，譜圖振幅隨照射時 間(jian)的延長(chang)而(er)不斷變(bian)大(da)。絕(jue)對(dui) 自旋(xuan)數(shu)報告(gao)表(biao)明(ming)，SpinCount 如(ru)何通(tong)過測(ce)定每(mei)個(ge)時間(jian)段的(de) 濃(nong)度，來體現自(zi)由基濃(nong)度隨 紫(zi)外光(guang)照射時間(jian)的變(bian)化。

利用SpinFit Liquids進行分子運(yun)動(dong)分析(xi)

. 自(zi)動(dong)測(ce)定運(yun)動(dong)狀(zhuang)態(tai)

. 計(ji)算旋(xuan)轉(zhuan)相關(guan)時間(jian)

CW EPR信(xin)號(hao)可以(yi)分為不同的(de)運(yun)動(dong)狀(zhuang)態(tai)。（1）各(ge)向(xiang)同性(xing)極(ji)限狀(zhuang)態(tai)：非粘性(xing)溶(rong)液(ye)中的(de)快速運(yun)動(dong)分子；（2）中間(jian)狀(zhuang)態(tai)：分為快速和(he)慢 速運(yun)動(dong)狀(zhuang)態(tai)，粘性(xing)溶(rong)液(ye)中的(de)樣品或(huo)分子量較(jiao)大(da)以(yi)致(zhi)於限制(zhi)分子運(yun)動(dong)的分子；（3）剛性(xing)極(ji)限狀(zhuang)態(tai)：粉末(mo)、玻璃和(he)冷凍(dong)溶(rong)液(ye)等(deng)固體(ti) 樣品。SpinFit Liquids模(mo)擬模塊適(shi)用(yong)於擬合所有液(ye)體(ti)樣品（包括(kuo)中間(jian)狀(zhuang)態(tai)和(he)各(ge)向(xiang)同性(xing)極(ji)限狀(zhuang)態(tai)）的譜圖。模擬包含(han)多(duo)個(ge)組(zu)分的 EPR譜圖，有助(zhu)於研究(jiu)復(fu)雜(za)生(sheng)物(wu)系(xi)統的動(dong)態(tai)。圖11所(suo)示為，與組(zu)氨酸(suan)激酶(mei)家族的(de)壹(yi)種(zhong)蛋(dan)白質結(jie)合的(de)ADP自(zi)旋(xuan)標(biao)記(ji)類(lei)似物(wu)（ADP- NO）的(de)EPR譜圖。從(cong)圖(tu)中可以(yi)看(kan)出，該譜圖是由兩個(ge)組(zu)分疊(die)加(jia)而成：三(san)條(tiao)窄線(xian)代(dai)表(biao)溶(rong)液(ye)中的(de)遊離ADP-NO，而(er)較(jiao)寬部分代(dai)表(biao)與

蛋(dan)白結合(he)的ADP-NO所(suo)產(chan)生(sheng)的(de)信(xin)號(hao)。分子運(yun)動(dong)速度通過旋(xuan)轉(zhuan)相關(guan)時間(jian)τ（單位：ns）來描(miao)述(shu)。旋(xuan)轉(zhuan)相關(guan)時間(jian)越(yue)短(duan)，分子運(yun)動(dong)速度

c

越(yue)大(da)。SpinFit Liquids允許(xu)同時(shi)進行多(duo)個(ge)組(zu)分的模(mo)擬，從(cong)而(er)獲(huo)得兩個(ge)組(zu)分的分子動(dong)態(tai)參數(shu)及(ji)它(ta)們(men)的(de)相對(dui)分數(shu)。這(zhe)些(xie)研究(jiu)可為了 解(jie)ATP依(yi)賴(lai)蛋(dan)白及生(sheng)物(wu)聚合物(wu)的功能(neng)提供(gong)重(zhong)要見解。