什(shen)麽(me)是(shi)熒(ying)光定(ding)量PCR

　　壹、是(shi)在PCR擴增(zeng)過(guo)程(cheng)中(zhong)，通(tong)過(guo)熒(ying)光信(xin)號，對PCR進(jin)程(cheng)進(jin)行實(shi)時(shi)檢測(ce)。由於(yu)在PCR擴增(zeng)的(de)指(zhi)數時(shi)期(qi)，模板(ban)的Ct值和(he)該(gai)模(mo)板(ban)的(de)起始拷貝數存在線性關(guan)系(xi)，所(suo)以(yi)成(cheng)為(wei)定量的依據。
 

　　二(er)、將標記(ji)有(you)熒(ying)光素(su)的Taqman探(tan)針與模(mo)板DNA混(hun)合(he)後，完(wan)成高(gao)溫(wen)變(bian)性，低(di)溫復性，適(shi)溫延伸的熱循(xun)環，並(bing)遵守聚合(he)酶鏈(lian)反應(ying)規律(lv)，與(yu)模板DNA互(hu)補(bu)配(pei)對的(de)Taqman探(tan)針被切(qie)斷(duan)，熒(ying)光素(su)遊(you)離於(yu)反應(ying)體(ti)系中(zhong)，在特(te)定(ding)光(guang)激(ji)發(fa)下發(fa)出熒(ying)光，隨著(zhe)循(xun)環次(ci)數的增(zeng)加，被擴增(zeng)的目(mu)的基(ji)因片(pian)段呈(cheng)指(zhi)數規律(lv)增(zeng)長，通過(guo)實(shi)時(shi)檢測(ce)與之(zhi)對應(ying)的隨擴(kuo)增(zeng)而變(bian)化(hua)熒(ying)光信(xin)號強(qiang)度，求得Ct值，同(tong)時(shi)利用數個已(yi)知(zhi)模板濃度的(de)標準品作(zuo)對照(zhao)，即可(ke)得(de)出待測(ce)標本(ben)目(mu)的基(ji)因的(de)拷(kao)貝數。
 

　　三、分(fen)子(zi)信(xin)標：是(shi)壹種(zhong)在5和(he)3末(mo)端自(zi)身形(xing)成(cheng)壹個8個堿(jian)基(ji)左右的發(fa)夾(jia)結構的(de)莖環雙標記(ji)寡核苷(gan)酸(suan)探(tan)針，兩(liang)端的(de)核(he)酸(suan)序列互補(bu)配(pei)對，導致(zhi)熒(ying)光基(ji)團(tuan)與淬滅(mie)基團(tuan)緊(jin)緊(jin)靠(kao)近，不(bu)會(hui)產(chan)生熒(ying)光。PCR產(chan)物生(sheng)成(cheng)後(hou)，退火過(guo)程(cheng)中(zhong)，分(fen)子(zi)信(xin)標中(zhong)間(jian)部(bu)分與(yu)特(te)定(ding)DNA序(xu)列配(pei)對，熒(ying)光基(ji)因與(yu)淬滅(mie)基因分(fen)離產(chan)生熒(ying)光。
 

　　四、競爭(zheng)法(fa)：選擇(ze)由(you)突(tu)變(bian)克隆(long)產(chan)生的(de)含(han)有(you)壹個新(xin)內(nei)切(qie)位點的外源競爭(zheng)性模(mo)板。在同(tong)壹(yi)反應(ying)管(guan)中，待測(ce)樣品與競爭(zheng)模板用同(tong)壹(yi)對引(yin)物(wu)同(tong)時(shi)擴增(zeng)(其中(zhong)壹個引(yin)物(wu)為(wei)熒(ying)光標記(ji))。擴(kuo)增後(hou)用內切(qie)酶消化(hua)PCR產(chan)物，競爭(zheng)性模(mo)板的產(chan)物被酶解(jie)為(wei)兩(liang)個片(pian)段，而(er)待測(ce)模板(ban)不(bu)被酶切(qie)，可通(tong)過(guo)電(dian)泳或(huo)高(gao)效(xiao)液(ye)相(xiang)將兩(liang)種產(chan)物分(fen)開，分別(bie)測(ce)定熒(ying)光強(qiang)度，根(gen)據已知(zhi)模板推(tui)測(ce)未知模(mo)板(ban)的起(qi)始拷貝數。